TCT液基细胞专用玻片分享免疫组化SABC法操作流程

    TCT液基细胞专用玻片分享免疫组化SABC法操作流程

    1、洗载玻片

    将载玻片置于重铬酸钾和浓H2SO4混合液中，目的是为了是载玻片上的硅胶等除去，同时使一些肉眼看不见的凹凸不平的表面变平整，便于组织吸附，然后置于清水中清洗，除去残余的重铬酸钾和浓H2SO4（大约冲一个小时左右），再将载玻片浸泡于酒精之中， 然后放到架子上，置于37 oC温箱中，将多聚赖氨酸涂布于玻片的表面，由于Lys带正电，而大多数的组织带负电荷，从而产生吸附作用。

    2、包埋组织

    先在铁模具中加入一些液态石蜡，先稍微冷却，然后再将待包埋的组织置于石蜡之中，并排列整齐，再将塑料模具盒盖上，最后加入少许液体石蜡，进行冷冻，使石蜡变成固态。

    3、切片

    将包埋好的组织从模具上取下来，并置于石蜡切片机上，切片机通过调节上下左右来来使组织和切割方向一致，然后调节切片的厚度，一般为5 um，如果比较难切，则可以适当调整厚度，用毛笔将切割的载玻片向外拉，并用小镊子将包含有完整组织的载玻片置于40 oC温水中。

    4、捞组织

    当组织载玻片置于40 oC温水中之前，要先将水浴中的气泡赶走，以免气泡受热上浮而贴到组织上，组织受热展开，最好是组织不起皱纹，用载玻片捞组织时，一般取载玻片的下1/3或者下1/2一般每种组织捞5-6张，其中2-3张是备用的，每张载玻片上通常捞两份组织，做对照使用，这样形成的误差就比较小了，而且捞载玻片的时候最好方向一致，以便观察，再将捞出来的载玻片置于架子上，放入37 oC温箱中烘干。

    5、脱蜡

    依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精，起脱蜡作用的主要是二甲苯，依据的是相似相溶的原理。一般在每个试剂中放10 min，天气热可以少放几分钟，相反，天气较冷的话就要适当延长脱蜡时间，一般为12-15 min。

    6、抗原修复

    脱蜡后在清水中冲洗一段时间，加入3%H2O2浸泡10 min，从而除去内源性的过氧化氢酶，然后倒掉H2O2，在清水中洗两次，再加入柠檬酸缓冲液，放入微波炉中蒸煮3 min（中火），一般刚到沸腾即可，冷却至室温，然后再蒸煮一次，冷却至室温，蒸煮的目的是为了使抗原的位点暴露出来。

    7、血清封闭

    冷却至室温后，将柠檬酸缓冲液倒掉，水洗2次，并将载玻片置于PBS中5 min，洗2次，擦干组织周围的PBS液，马上加上血清，使一些非特异性的位点封闭起来，然后放入37 oC温箱中半小时。血清稀释10倍（900 ul PBS：100 ul血清封闭液）。

    8、加一抗

    将温箱中的载玻片取出，用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围的血清，加一抗，如果做对照实验，就在对照的组织上加PBS。加完一抗后于4oC冰箱中保存过夜。

    9、加二抗

    将载玻片从冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上二抗，然后置于37oC温箱中半小时。

    10、加SABC

    将片子从温箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上SABC， 然后置于37oC 温箱中半小时。SABC稀释100倍（990ul PBS：10ul SABC）。

    11、加显色剂

    将片子从温箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上显色剂。（显色剂的配置：在1ml水中加1滴显色剂A，摇匀，然后加1滴显色剂B，摇匀，再加1滴显色剂C，摇匀）   A：DAB   B：H2O2   C：磷酸缓冲液

    12、复染

    将显色后的片子用清水冲洗一段时间后，浸泡于苏木精中染色，一般动物组织为半分钟，植物组织3-5min。

    13、脱水

    将复染后的片子置于水中冲洗后，依次将载玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每个试剂中放置2min，最后浸泡在二甲苯中，搬到通风柜中。

    14、封片

    用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上，要先放平一侧，然后轻轻放下另一侧，以免产生气泡，封好片子后置于通风柜中晾干。